作用：對(duì)環(huán)境滅菌（空氣）。（備注：如果著急，至少也要開15分鐘），在做實(shí)驗(yàn)之前考慮好需要哪些物品。開始照射之前，將所需要用到的物品都放到生物安全柜（或超凈工作臺(tái)）里面。常用移液槍或電動(dòng)移液器等，需要在工作臺(tái)上放置一套專用設(shè)備。細(xì)胞培養(yǎng)箱一般都已經(jīng)調(diào)整好。定期留意一下二氧化碳是否足夠。不夠及時(shí)更換。

注意：顯微鏡一般都放在細(xì)胞房。

首先給自己帶上拖鞋、頭套，口罩，實(shí)驗(yàn)服，手套（手套帶雙層）。注意：手套要將袖口套進(jìn)去。實(shí)驗(yàn)服、拖鞋最好是細(xì)胞房專用。

首先觀察細(xì)胞培養(yǎng)液的顏色?，F(xiàn)在的細(xì)胞培養(yǎng)液通常都放有酸堿指示劑（絕大部分是酚紅）。細(xì)胞在培養(yǎng)生長過程中，不斷在培養(yǎng)液上清中累積酸性物質(zhì)，時(shí)間長了，培養(yǎng)液變?yōu)辄S色（同時(shí)培養(yǎng)液中營養(yǎng)物質(zhì)耗盡）。

其次鏡下觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)是否良好，是否需要傳代。如果生長狀態(tài)不好，需要對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行調(diào)整（一般是加大血清濃度）。過于密集出現(xiàn)大片融合或太密集而導(dǎo)致細(xì)胞脫落，則進(jìn)行傳代。

如果長勢(shì)良好，且細(xì)胞培養(yǎng)液顏色未發(fā)生變化，可以酌情進(jìn)行1/2、 1/3、1/4換液，也可以全換液?？傊?，視細(xì)胞生長情況而定。

首先是準(zhǔn)備各種溶液：第一是配制溶液過程中要用到的水。水用純水，高壓滅菌之后，再去內(nèi)毒素。去內(nèi)毒素方法很多，zui簡單可以放在烘箱180度3小時(shí)。或者過去內(nèi)毒素的柱子后，高壓滅菌。

第二，各種溶液滅菌：抗生素用去內(nèi)毒素水配制后，直接過濾除菌（過0.22u濾頭）。可以用一次性無菌注射器過一次性0.22u濾頭。

現(xiàn)在用的培養(yǎng)液，如果是商業(yè)化液體培養(yǎng)基，不用處理。如果是粉末，需要用去內(nèi)毒素水在生物安全柜（或超凈工作臺(tái)）進(jìn)行配制，再過濾除菌?？梢韵扰錆饪s液（如10×），過濾除菌后。再用滅菌去內(nèi)毒素水稀釋成1×培養(yǎng)液。

第三，完培的配制：培養(yǎng)液加上合適比例的血清即可。但血清一般保存于－20℃，一般解凍是放在4℃冰箱解凍，耗時(shí)長，而且必須解決完之后，才能進(jìn)行完培養(yǎng)基的配制。所以要提前幾個(gè)小時(shí)就將血清從－20℃轉(zhuǎn)入4℃，以至解凍。當(dāng)然如果這一次就需要用完的話（是指用這些血清配制的培養(yǎng)液都用完），也可以放到37℃解凍。

第四，最重要的是保證過程中無菌。液體必須要分裝。無論過程中用到的培養(yǎng)液、胰酶、血清、PBS、生理鹽水、抗生素盡量分裝。分裝是為了防止污染。如果操作有誤，僅能威脅到其中一支，而非整個(gè)。

培養(yǎng)液、血清、PBS、生理鹽水分裝為20mL、50mL或100mL/管胰酶、抗生素可分裝為1mL/管。分裝最好先于細(xì)胞操作。

第五，操作之前，培養(yǎng)液先放到37度的細(xì)胞培養(yǎng)箱里復(fù)溫。原因：盡量減少對(duì)細(xì)胞的刺激。低溫對(duì)于細(xì)胞也是一個(gè)刺激因素。

第六，操作之前，大腦先過一遍此次操作所需要用到的所有用具。將所有用具先放到無菌臺(tái)面上。減少拿入拿出的動(dòng)作，保證無菌。（如果萬一發(fā)現(xiàn)少拿了什么，也不要緊，再加上就是。如果是槍頭盒、移液管等用具，最好先用消毒酒精噴一下）。

第七，操作之前，帶著的手套先噴消毒酒精。然后再進(jìn)入工作臺(tái)。等一分鐘，等手套上的酒精揮發(fā)之后再進(jìn)行操作。

注意無菌。無論哪一管液體，開蓋后盡量立即關(guān)上（如果有幾瓶都需要開的，也注意，可以虛蓋）。蓋子向上放。操作時(shí)不要從開蓋的容器上方經(jīng)過。另外，無菌臺(tái)面上擺放的各種東西，最好是一字?jǐn)[開，平行于自己。盡量不要前后重疊。

細(xì)胞操作中所用的所有耗材試劑最好都是細(xì)胞培養(yǎng)專用。一般都以一次性耗材居多。1ML槍頭為加長型專用培養(yǎng)槍頭。移液管亦有專用10mL一次性無菌移液管

（1）細(xì)胞換液：培養(yǎng)皿/瓶用槍頭或移液管吸去原培養(yǎng)液，加入新培養(yǎng)液。

（2）細(xì)胞傳代：傳代之前先觀察，細(xì)胞是否密集，是否開始融合。一般融合達(dá)到70－80%就可以傳代。早點(diǎn)傳代也可以。

如果是貼壁生長的細(xì)胞：

1） 培養(yǎng)皿/瓶用槍頭或移液管吸去原培養(yǎng)液；

2） 無菌PBS或無菌生理鹽水洗滌3次（按培養(yǎng)體積加入）；

3） 加入適量胰酶消化適當(dāng)時(shí)間（一般胰酶為0.25%；9cm/10cm培養(yǎng)皿和25cm培養(yǎng)瓶，一次加入1mL胰酶。消化時(shí)間視細(xì)胞類型等多種情況綜合考慮，一般如果是細(xì)胞株，非原代培養(yǎng)，消化1－2分鐘足矣）；

4） 用槍頭吹打數(shù)十次（視細(xì)胞類型而定。一般細(xì)胞株30－50次吧，耗時(shí)一般2分鐘左右）；

5） 加入適量體積完培終止胰酶消化（如果是9cm/10cm培養(yǎng)皿和25cm培養(yǎng)瓶，可以加入1mL完培；現(xiàn)在培養(yǎng)瓶（皿）里有2mL溶液）。

6） 現(xiàn)在可以將溶液進(jìn)行分瓶（2mL）。如果是細(xì)胞株，直接均分到兩個(gè)培養(yǎng)瓶（皿）里。如果是原代培養(yǎng)，可以根據(jù)消化時(shí)間來對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分離；因此可以將溶液（2mL）都轉(zhuǎn)入新的培養(yǎng)瓶（皿）。

7） 將兩個(gè)培養(yǎng)瓶（皿）補(bǔ)足完培到正常體積（果是9cm/10cm培養(yǎng)皿和25cm培養(yǎng)瓶，為5mL完培）。

8） 鏡下觀察。剛剛傳代細(xì)胞還沒貼壁，懸浮在溶液中，呈圓形。一般2h之內(nèi)會(huì)貼壁，如果已經(jīng)貼壁，根據(jù)細(xì)胞類型有不同的形態(tài)，但通常都不是圓形。

9） 鏡下觀察無誤之后，再放入細(xì)胞培養(yǎng)箱。培養(yǎng)瓶（皿）放入之前，可以用消毒酒精先擦一下。

10） 傳代之后，最好第二天細(xì)胞換液一次。當(dāng)然，也可以視情況而定。

物品歸位，倒出垃圾。再開紫外照射30min。

第一，經(jīng)常觀察。最好是每天都顯微鏡下看一看，確定細(xì)胞狀態(tài)。然后該換液換，該傳代傳，不用理會(huì)的就原樣放回去。如果好幾天都不想理會(huì)，可以放完培，或者低血清濃度的培養(yǎng)液，維持細(xì)胞生存，但不增殖。

第二，是否加抗生素。這個(gè)視情況而定。細(xì)胞培養(yǎng)過程中，是要求盡量少添加不相關(guān)的雜質(zhì)。抗生素對(duì)于細(xì)胞來說，也是一種負(fù)擔(dān)。但如果環(huán)境比較污染，直接添加好了。好比沒病不用吃藥，感冒了還是要吃藥；嬰兒沒病但還是要打疫苗。

第三，胎牛血清的解凍。血清一般保存于－20℃，要放在4℃冰箱解凍，耗時(shí)長，500mL要好幾個(gè)小時(shí)，我們經(jīng)常是頭天離開實(shí)驗(yàn)室之前放到4℃冰箱，過夜。所以經(jīng)常分裝成10mL或者20mL。這樣，上午放到4℃冰箱，下午就可以用了。

第四，是否一定要細(xì)胞房。以及是否要嚴(yán)格的遵守種種器具專用。這個(gè)吧，見仁見智。凡所有種種措施及設(shè)備都是為了保證培養(yǎng)操作過程中無菌，減少感染的機(jī)率；專用試劑耗材保證無菌無內(nèi)毒素。